Poliakrilamido gelio elektroforezės (PAGE) gamybos procesas daugiausia apima tokius veiksmus kaip gelio paruošimas, elektroforezės operacija, dažymas ir rezultatų stebėjimas.
Gelio paruošimas Atskyrimo gelio (10 %) paruošimas: sumaišykite 0 ml ddH₂O, 3 ml 30% pradinio gelio, 5 ml 5 mol/L Tris-HCl, 1 ml 10% SDS ir 1 ml 10% AP, tada įpilkite 10 μL dugno, tada įpilkite 4 μL. TEMED ir gerai išmaišykite. Supilkite šį mišinį tarp stiklinių plokščių, uždenkite viršų vandeniu ir palaukite 30–60 minučių, kol gelis visiškai polimerizuosis.
Krovinio gelio (4%) paruošimas: sumaišykite 4 ml ddH₂O, 33 ml 30% pradinio gelio, 25 ml 1 mol/L Tris-HCl, 0,2 ml 10% SDS ir 0,2 ml 10% AP, nedelsdami įpilkite 2 μL TEMED ir gerai išmaišykite. Nupilkite vandenį ant atskyrimo gelio, supilkite šį mišinį ir nedelsdami įkiškite šukas tarp stiklinių plokščių, palaukite 15-30 minučių, kol susikaupęs gelis visiškai polimerizuosis.
Elektroforezės operacija Mėginio apdorojimas: sumaišykite mėginį su lygiu kiekiu 2XSDS pakrovimo buferio, kaitinkite 100 laipsnių temperatūroje 3-5 minutes, tada centrifuguokite 12 000 aps./min. greičiu 1 minutę, o supernatantą paimkite SDS-PAGE analizei.
Pakrovimas: paimkite 10 μL indukuotų ir neindukuotų mėginių ir pridėkite juos prie mėginių telkinio, o kaip kontrolę įpilkite 20 μL mažos molekulinės masės baltymų etalonų.
Elektroforezė: į elektroforezės baką įpilkite 1X elektroforezės buferio, prijunkite maitinimo šaltinį, palaikykite 60 V krovimo gelio įtampą, o atskyrimo gelio – 100 V. Kai bromfenolio mėlynasis pasiekia elektroforezės bako dugną, sustabdykite elektroforezę (apie 3 valandas).
Dažymas ir rezultato stebėjimas
Dažymas: nuimkite gelį nuo stiklinės plokštelės ir dažykite Coomassie Brilliant Blue dažymo tirpalu 4–6 valandas kambario temperatūroje. Dėvimų šalinimas: nudažytą gelį įdėkite į nešvarumų šalinimo tirpalą ir keletą kartų nuvalykite, kol baltymo juostelė bus aiškiai matoma. Rezultatų stebėjimas: po dažymo gelį galima nufotografuoti ir išsaugoti. Baigę dažymo etapą, padėkite gelį po vaizdo apdorojimo sistema fotografavimui ir išsaugokite rezultatus diskelyje.